PCNA 的 shRNA 对子宫颈癌细胞的抑制研究

 

 

黄 浩¹    凃 欣²    余南才¹    吴文莉¹

 

刘 倩¹    马 威¹    郝建军¹    易艳东¹

 

¹ 武汉市第一医院实验中心  武汉 430022

 

² 华中科技大学人类基因组研究中心 武汉 430074

 

摘要 目的:构建增殖细胞抗原(PCN A)的小发夹结构 RN A(sh RNA)的真核表达载体并在 HeL a 细胞表达,同时观察 PCN A 的 shRN A 对人 H eLa 细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。 方法:将 PCN A 的 cDN A 的 shRN A 引物插入真核表达载体 pG enesil-1, 构建真核表达质粒 pG enesil-1-P CNA 1-4, 并通过酶切和测序等方法进行鉴定, 将真核表达质粒pGenesil-1-PCN A 1-4 转染子宫颈癌细胞, 运用W estern blo t 检测 PCN A 的蛋白表达, 流式细胞仪分析细胞周期变化。 结果:PCNA 的 shRN A 能显著抑制人 HeL a 细胞的生长, 阻滞细胞 G0 /G 1-S 期, P CNA 的蛋白表达同时受到抑制。 结论:PCNA 的 shRN A 能显著抑制人 H eLa 细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断 PCN A 蛋白表达实现, 实验结果为进一步研究 PCN A 的 shRNA 对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

 

关键词 子宫颈癌;增殖细胞核抗原;小发夹结构 RNA ;子宫颈癌细胞;

 

中图分类号     R737. 3    文献标识码 A  文章编号 1671-8852(2006)02-0170-04

 

 

Inhibition of HeLa Cells by Small Hairpin RNA of PCNA

 

HUANG Hao¹ , TU Xin² , YU Nancai¹ , WU Wenli¹  , LIU Qian¹  , MA Wei¹  , HAO Jianjun¹  , YI Yandong^{2 1} Center of E x perimental Medicine , the F irst H osiptal of Wuhan ,Wuhan 430022 , China

 

² Human Genome Research Center , Huazhong University of Science &Technology , Wuhan 430074 , China

 

Abstract

 

Objective :To co nstruct eukaryo tic expression plasmid of small hairpin RNA (shRNA) of PCNA , and to investigate the inhibitory effect o f shRNA of PCNA o n HeLa cell proliferation. Methods:The cDNA shRNA prime of PCNA w as inserted into do w nstream of the vector pGene-sil-1 to o btain the recombinant eukary otic ex pression plasmid pGenesil-1-PCNA1-4 w hich w as identified with the methods of enzym e digestio n and sequence analy sis. And then transfected the recom binant plasmid pGene sil-1-PCNA1-4 into eukary otic H eLa cells by cationic po lymer-media-ted transfection. The inhibition o f H eLa cell prolife ration w as estimated by imm unohistochemis-try and Western blot method , and the cell cycle w as analy zed by flow cy to metry . Results:The shRNA of PCNA inhibited the g row th rate o f HeLa cells and arrested pro liferatio n o f He La cells in stage of G0 /G1-S. Conclusion :The shRNA of PCNA mig ht inhibit the prdiferatio n o f He La cell lines by inbiting ex pression of PCNA , and the results are helpful fo r further researching in gene therapy of uterine ce rvix carcinoma.

Key Words      Uterine Cervix Carcinom a ;Pro liferating Cell Nuclear A ntigen ;Small H airpin

 

 

作者简介:黄浩, 男, 1972-, 医学硕士, 主要从事病原生物学方面的研究

 

通讯作者:凃欣, 男, 1974-, 医学博士, 主要从事致病基因分子生物学方面的研究

第 2 期                                         黄 浩, 等. PCN A 的 shRNA 对子宫颈癌细胞的抑制研究                                                       171

 

RNA ;HeLa Cell

 

肿瘤的发生与基因突变及细胞增殖有关。增殖细胞核抗原(Pro liferating cell nuclear antig en , PC-NA)是在细胞周期 S 期广泛表达的一种核蛋白, 是一种仅在增殖细胞中合成和表达的 36 kU 多肽 , 其功能是 DNA 聚合酶δ的重要辅助蛋白 ,在 DNA 合成中是绝对必需的, 在细胞增殖过程中有重要意义, PCNA 阳性表达说明该细胞正处于增殖状态 。因

 

此 , PCNA 作为一项评估细胞增殖状态的指标不仅用于病理学研究, 而且近年来在肿瘤研究中的应用日渐增多^{[ 1]} 。

 

RNA 干预(RNA interference ,RNAi)本质是一种双链 RNA(do uble-stranded RNA , dsRNA)分子

 

在 m RNA 水平上关闭相应序列基因的表达或使其

 

沉默的过程 , 也就是序列特异性的转录后基因沉默^{[ 2]} (Po st-transcriptional gene silencing , PTGS)。 shRNA 是 45-50-mer 的小发夹结构 RNA (small hairpin RNA , shRNA), 通过将其转染到细胞。 shRNA 在细胞内会自动被加工成为 siRNA ,从而引发基因沉默或者表达抑制^{[ 3]} 。

 

我们根据 PCNA 的 cDNA 的序列设计 shRNA

 

的引物, 插入真核表达载体 pGenesil-1 , 构建正确的真核表达质粒 , 导入 He La 细胞中并研究其产生 siRNA 对 H eLa 细胞干预的影响。为 RNAi 干预技术对肿瘤的基因治疗提供了实验理论和基础。

 

1       材料与方法

 

1. 1   细胞培养 HeLa 细胞引自武汉大学生命科学

 

院 ,培养于含 10 %小牛血清的 DM EM 的培养液中,37 ℃,5 %的 CO2 条件下培养,0. 3 %的胰酶消化和传代。

 

1.  2  shRNA 设计和合成 根据 PCNA 基因序列

 

(NM_182649), shRNA 设计规则及 blast 同源搜索选取 、设计四对引物及一对对照引物 ,每一对引物上游含 B am H Ⅰ切点之后 GA TCC 的粘性末端, 引物下游互补端含 H ind Ⅲ切点的互补的 TTCGA 粘性末端 ,武汉市晶赛生物技术有限公司合成。

 

1.  3 PCNA 的 shRNA 的真核表达载体的构建 将真核表达载体 pGene sil-1 和经 B am H Ⅰ , H ind Ⅲ双

 

酶切后与纯化的含相应粘性末端的 PCNA 基因的

 

shRNA 四对引物片段和一对对照引物片段 ,进行线性连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 DH 5α, 经小量提取质粒测序鉴定。构建的表达质粒称

 

 

 

 

 

pGenesil-PCNA-1 、pGenesil-PCNA-2 、pGenesil-PC-NA-3 、pGenesil-PCNA-4 、pGenesil-PCNA-H K 。

 

1.  4  阳离子聚合物(梭华-Sofast^TM /DNA 试剂盒)介

 

导的细胞转染 细胞培养至 40 %-60 %汇合, 配制不同浓度的 pGenesil-PCNA-1-4(浓度 2. 5 , 7. 5 , 10 ,

 

12.  5 , 15 μg /ml)梭华-So fast^TM /DNA 复合物 , 进行转染 ,具体操作步骤见试剂盒说明书。

 

1.  5  流式细胞仪(FCM)检测 收集 1. 0 ×10⁶ 细胞,

 

用 70 %冷乙醇固定 , 加 RNaseA (终浓度 50 μg / m l),用 37 ℃水浴 1 h ,加碘化丙啶(PI ,终浓度 20 μg /m l),暗处冰浴染色 1 h 。用流式细胞仪检测细胞周期分布, 用通过 Mo dFitLT3. 1 软件分析 。

 

1.  6  Western blot 定量检测 PCNA 蛋白 转染细胞

 

如 1. 4 ,收集转染及正常的细胞 ,裂解液裂解 , 取 20 μl 裂解样品液, 进行 SDS-PAGE 蛋白电泳, 表达产物电转移至硝酸纤维素膜上 ,进行 Western blo t 反应, 通过 BandScan 5. 0 软件对杂交图进行分析, 以 β-actin 做为定量 M aker ,20 pmol 为定量单位。

 

1.  7 统计学分析应用 t 检验进行差异分析 , 以 P <0. 05 为差异有显著性意义。

 

2        结果

 

2. 1   PCNA shRNA 对细胞增殖的影响

 

2. 1. 1 细胞光镜观察(见图 1 , 图 2) 由图 1 , 2 可知正常细胞呈致密的上皮 ,在转染了四种引物的真核表达载体 24 h 后, 细胞都发生显著变化, 周边细胞脱落死亡 ,细胞形态呈梭形, 中间细胞聚集成团,类似于孤岛状。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 1  未转染的 HeLa 细胞 24 h 后细胞形态(×200)

 

Fig. 1  Hela cells without transfection at the 24 h

 

图 2 转染了 pGenesil-PCNA-1-4HeLa 细胞 24 h 后细胞形态(×200)

Fig. 2    pGenesil-PCNA-1-4Hela cells at the 24 h

 

2.  2  流式细胞仪(FCM)检测细胞周期 (见图 3 、

 

图 4)

 

通过 ModFit L T3. 1 软件分析以上细胞周期图,

172                                                                              武汉大学学报(医学版)                                                                         第 27 卷

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 3   未转染的 HeLa 细胞, 24 h 后细胞周期

 

Fig. 3    Hele cell cycle without transfection at the 24h

 

 

的 H eLa 细胞均可见在 43 kU 的 β-actin M aker 略

 

下方可见清晰杂交带 ,将没有转染的正常 H eLa 细

 

胞与转染 12. 5 μg /ml 时的 pGenesil-PCNA-H K 、 pGenesil-PCNA-1-4 的 24 h 后 Western blot 杂交图进行 Band Scan5. 0 软件分析,以β-actin 为内参定量 M aker ,得出结果分别为 11. 84 , 11. 32 , 1. 14 , 4. 43 ,

 

1. 14 ,0. 51 ,转染了 4 种真核表达的质粒的细胞的表达 PCNA 的蛋白量匀显著降低, 其中转染 pGenesil-

 

PCNA-4 最显著。

 

3       讨论

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 4 转染 pGenesi-PCNA-4 , 12. 5 μg/ml , 24 h 后细胞周期

 

Fig. 4    pGenesi-PCNA-4Hele cell cyle at the 24h

 

子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。它严重威胁妇女的生命健康 ,但其发病机制尚不清楚 ,已有很多资料表明:子宫颈癌 PCNA 表达率明显高于非癌性子宫颈上皮 ,且在子宫颈癌中 PCNA 表达率随分化程度的降低而增高, 表明 PCN A 的表达能作为反映子宫颈癌细胞的增殖活性的指标^{[ 4]} 。

应用反义技术封闭 PCNA 的研究, 目前主要集中在研究增殖性血管性疾病 ,仅有少数报告用来研究增殖性肾病和胃癌的治疗^{[ 5]} 。但至今未见应用 PCNA 的 shRNA 技术封闭 H eLa 细胞增殖的报道。

 

实验中我们通过流式细胞术分析细胞周期发现

 

pGenesil-PCNA-1-4 各组转染的肿瘤细胞中 , G1  期

 

细胞数明显增多,S 期细胞数明显减少 ,G2  期细胞数

 

正常 HeLa 细胞 24 h 后

G0  G1  期占 37. 46

S 期

减少, pGenesil-PCN A-4 组减少最显著。 提示

,

% ,

pGenesil-PCNA-1-4 可能延缓了肿瘤细胞由 G1  期

39. 23

G2  M 期23. 31

-

向 S 期的过渡。证实我们构建的 shRNA 真核表达

%,

-

%,

μ

-

载体都具有有效性。

si-PCNA-4

0

1

期占

57. 23 %, S  期

, 24  h 后 G -G

29. 12 %,G2-M 期13. 65 %,在分析 pGenesil-PCNA-

我们通过 We ste rn blo t 及 BandScan5. 0 软件分

1 4 各组转染的肿瘤细胞中

我们发现 G1  期细胞数

析了转染 5 ml - 1 、7. 5 ml - 1 、10 ml - 1 、12. 5 ml - 1  、15

-

,

在转染 pGenesi

m l - 1 各种浓度的 pGenesil-PCNA-1-4 , 将结果与对

明显增多

,

S 期细胞数明显减少

,

。

-

照组比较, 发现表达 PCNA 蛋白量匀有显著性差

PCNA 4 时 G2  期细胞数明显减少

-

异。转染 pGenesil-PCN A-4 组的 PCNA 蛋白量降

2. 3  Western blot 检测 PCNA 蛋白 各种质粒转染

12. 5 m l - 1 时 Western blot 杂交图见图 5 。

低最为显著, 转染各种浓度的质粒的 PCNA 蛋白表

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 5  Western Blot 检测 PCNA

 

Fig. 5   PCNA expressed detected with western blot analysis

 

由图 5 可知, 没有转染的正常 H eLa 细胞和转染了 pGenesil-PCNA-H K 、pGenesil-PCNA-1-4 质粒

 

达量匀明显下降, 进一步证实了我们构建的 4 种 shRNA 真核表达载体均具有有效性 , 其中, pGene-sil-PCNA-4 的有效性最好。实验结果表明 :我们设计的四种 PCNA 的 shRNA 不仅抑制了 H eLa 细胞的生长、DNA 和 PCNA 蛋白合成, 而且明显阻滞了 H eLa 细胞由 GO /G1 期进入 S 期。而相同浓度的对

 

照 pGene sil-PCNA-H K 对 H eLa 生长无明显抑制作用, 提示 PCNA 的 shRNA 对 H eLa 细胞抑制作用具有特异性。

 

应用 PCNA 基因 shRNA 阻断特定的基因表

第 2 期                                         黄 浩, 等. PCN A 的 shRNA 对子宫颈癌细胞的抑制研究                                                       173

 

达 ,可以明显抑制 H eLa 细胞的增殖, 改变肿瘤细胞的生物学行为。为合理地利用反义技术改变和逆转致病瘤细胞恶性表型肿瘤的基因治疗提供了一个方向。

 

参考文献

 

[  1]  L i L , Da J , Stucki M , et al.  Int J A ntiprolifera tive ac-

 

	tivity	and  to xicity  of	2-methox yestradio l in  cervical
	cancer	xenog raft mice[	J]	.  Gy necol Cance r ,	2005, 15
	(2):301-307.
[ 2]	K uninge r D , S tauffer D ,			Ef tekhari S , e t al.	Gene dis-
	ruption by reg ulated short interfering RN A ex pression ,
	using a tw o-adeno v irus		sy stem[ J] .  H um Gene T he r ,
	2004 , 25(12):1 287-1 292.
[ 3]	Spankuch B , M at thess Y ,			Knecht R , et al. Cancer in-

 

 

hibition in nude mice af te r systemic application of U6 promo te r-driven short hairpin[ J] . J N atl Cance r Inst , 2004, 96(11):862-872.

[ 4]  A rrighi JF , Pio n M , Wiznerow icz M . L entivirus-medi-ated RN A interference of DC-SIG N expre ssio n inhibits human immuno deficiency virus transmission f rom de n-

 

dritic cells to  T  cells[ J] .        J Viro l,    2004,   78(20):

 

10 848-10 855.

 

[  5]  Hasan S , Stucki M , H assa PO .  Regulatio n of human flap endonuclease-1 activity by acety lation through the

 

transcriptio nal co activa to r p300[ J] .  M ol Cell ,	2001, 7
(6):1 221-1 231.
(2005-08-31 收稿)
编辑	沈建国